Моноклональные антитела очищают методами

Бакалавр, Нижегородский государственный технический университет им. В статье рассмотрено использование моноклональных антител в иммунотерапии и иммунодиагностике онкологических заболеваний и их производство с использованием гибридомной технологии, представлена технологическая схема и машинно-аппаратурная схема производства.

Дорогие читатели! Наши статьи рассказывают о типовых способах решения проблем со здоровьем, но каждый случай носит уникальный характер.

Если вы хотите узнать, как решить именно Вашу проблему - начните с программы похудания. Это быстро, недорого и очень эффективно!


Узнать детали

Достижения фармацевтики: моноклональные антитела

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Организация производства и контроль качества моноклональных антител. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.

Тарасевича Ж. И Авдеева, Т. Бектимиров , Р. Волкова, Н. Медуницын, В. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Онищенко 4 мая года. Введены в действие с 1 августа года. Область применения. Нормативные и методические ссылки. Сокращения, термины и определения. Основные положения, которые необходимо учитывать в производстве.

Производственный процесс. Биологические материалы, используемые в производстве. Характеристика неспецифических клеток. Фидерные клетки. Партнер ы слияния. Клетки хозяина для экспрессии рекомбинантных моноклональных антител. Получение и характеристика специфических родительских клеток моноклональные антитела мыши и человека 8. Линия клеток, продуцирующая моноклональные антитела.

Получение линии клеток. Характеристика линии клеток. Линия клеток, продуцирующая рекомбинантные моноклональные антитела. Клонирование и характеристика ДНК, кодирующей неспецифические участки рекомбинантных моноклональных антител.

Селекция, клонирование и характеристика ДНК, кодирующей специфические участки рекомбинантных моноклональных антител. Конструкция гена, кодирующего рекомбинантное моноклональное антитело. Получение линии клеток, экспрессирующей рекомбинантные моноклональные антитела. Генетическая стабильность. Система банков клеток. Контроль вирусной и микробной контаминации. Секреция цитокинов. Создание Послепроизводственного банка клеток. Характеристика моноклональных антител.

Специфичность и перекрестная реактивность. Производство в условиях in vitro. Производство с однократным сбором продукта. Производство с многократным сбором продукта. Производство in vivo. Характеристика используемых животных. Сбор и работа с асцитной жидкостью.. Вирусологические аспекты: контроль в процессе производства.

Очистка антител. Валидация очистки. Конечный полуфабрикат. Моноклональные антитела. Посторонние агенты.. Стабильность производства и рутинный контроль конечного полуфабриката. Стабильность производства. Рутинный контрольный анализ серии. Тестирование активности. Спецификации и стандартные материалы.. Модифицированные моноклональные антитела. Конечный продукт и разработка готового лекарственного продукта.

Эквивалентность продукта. Исследования эквивалентности продукта in vitro. Исследования эквивалентности продукта in vivo. Клинические исследования. Приложение 1 Оценка вирусной контаминации. Приложение 2 Ткани человека, используемые при оценке перекрестной реактивности моноклональных антител.

Приложение 3 Общие сведения о моноклональных антителах. Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации. Методические рекомендации МР 3. Настоящие методические рекомендации разработаны на основании международных регламентирующих документов по качеству ICH и СРМР, и содержат единые подходы к организации производства и контролю качества генно-инженерных моноклональных антител, предназначенных для терапевтического и диагностического in vivo использования у человека.

Методические рекомендации предназначены для органов и учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора, специалистов организаций, независимо от их организационно-правовой формы, разрабатывающих условия производства и производящих препараты моноклональных антител, составляющих нормативно-техническую документацию на указанные препараты, а также для организаций, осуществляющих инспектирование условий производства и контроль качества препаратов моноклональных антител.

Закон РФ от 22 июня г. ГОСТ "Входной контроль продукции". МУ "Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов", МУ "Определение класса чистоты производственных помещений и рабочих мест. Приборы и методы", МУ "Приготовление, хранение и распределение воды очищенной и воды для инъекций", МУК 4. РД "Требования к моноклональным антителам для клинических целей".

РДИ "Порядок проведения контроля параметров воздушной среды в "чистых" помещениях и методы их измерений при производстве лекарственных средств". Нифантьев О. Директива для предприятий - Общая - Лекарственные средства, CDR - области, определяющие комплементарность связывания молекулы иммуноглобулина. Исходная линия клеток не обязательно должна быть получена производителем. Для инженерных продуктов клетки в Основном банке клеток уже трансформированы вектором экспрессии, содержащим желаемый ген.

В некоторых случаях существует необходимость создания отдельных банков клеток - для вектора экспрессии и клеток хозяина. В обоих банках клеток все емкости во время хранения находятся в идентичных условиях. Емкость после взятия из места хранения в общий банк клеток не возвращается. Генно-инженерные моноклональные антитела - моноклональные антитела человека, в которых критические аминокислотные остатки заменены с помощью методов молекулярной технологии.

Готовый продукт - это активная субстанция, сведенная с компонентами готовой формы, расфасованная, укупоренная; каждая емкость содержит продукт в его окончательной дозированной форме. Емкости, заполненные одной серией продукта, обработаны одновременно, имеют одинаковый состав и одинаковую биологическую активность.

Конечный полуфабрикат активной субстанции - это конечный продукт после завершения производственного процесса, полученный из объединенного сбора продукта. Он содержится в одной или более емкостях и используется для приготовления готовой лекарственной формы. Формирование этой конечной серии продукта должно быть четко установлено и документировано производителем. Мышиные антитела - антитела получены от животных, принадлежащих семейству Muridae, которое включает в себя мышей и крыс.

Объединенный сбор - это гомогенный пул индивидуальных сборов продукта, лизатов или асцитных жидкостей, которые произведены в течение одного производственного цикла. Партнер слияния - линия клеток, с которой осуществляют слияние клеток, продуцирующих антитела, для того, чтобы сделать эти клетки "бессмертными".

Фидерные клетки - культура клеток, культивируемых совместно с линией клеток, продуцирующих антитела, чтобы обеспечить оптимальные условия их роста. В этом документе рассматриваются требования для мышиных, человеческих и генно-инженерных моноклональных антител, предназначенных для терапевтического включая применение ex vivo и диагностического in vivo использования у человека.

Моноклональные антитела, предназначенные для очистки других медицинских иммунобиологических препаратов МИБП , должны быть очищены и свободны от контаминирующих агентов, что достигается описанными ниже методами. Моноклональные антитела, предназначенные для диагностических целей in vivo, не являются предметом рассмотрения данного документа.

Целью введения в действие настоящих методических рекомендаций далее - MP является систематизация и унификация требований к организации производства и надзора за качеством на предприятиях, осуществляющих разработку и производство генно-инженерных моноклональных антител, предназначенных для терапевтического и диагностического in vivo использования у человека, а также осуществляющих разработку нормативно-технической документации на указанные препараты.

Методические рекомендации предусматривают требования к инспектированию условий производства и контроля качества моноклональных антител на соответствие их требованиям GMP и регламенту производства на конкретный препарат.

Получение и очистка моноклональных антител Получение и очистка моноклональных антител Получение и очистка моноклональных антител. В г.

Техника получения моноклональных антител. Иммуноферментный анализ. Продолжение. X077

Получение и очистка моноклональных антител Получение и очистка моноклональных антител Получение и очистка моноклональных антител. В г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомной технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены.

В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линией миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы invitroза несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена.

Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах. Последние достижения в этой области включают получение антиидиотипических антител и моноклональных антител овцы межвидовым слиянием клеток. Кроме того, получены моноклональные антитела человека как из гибридом, образованных с помощью внутри- или межвидового слияния клеток, так и из культуры В-лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна — Барра.

Другими большими достижениями, важными для практики, являются получение биспецифических антител из гибридных гибридом и создание химерных антител с помощью трансфекции генов иммуноглобулинов в миеломные клетки. Традиционный метод получения больших количеств моноклональных антител включает введение мышам или крысам гибридомных клеток выбранного клона с последующим развитием опухолевых асцитов и отбором асцитной жидкости.

От одной мыши можно получить до 50 мг антител. Однако при получении очень больших количеств антител использование животных уже нецелесообразно, поскольку для получения 1 кг очищенного продукта потребуется 20 мышей. Следовательно, необходимо развивать промышленную технологию получения моноклональных антител invitro. Методы выращивания гибридом invitroимеют ряд преимуществ по сравнению с методами получения антител invivo:. Существуют два подхода к культивированию животных клеток. Первый подход основан на иммобилизации и включении клеток в твердую матрицу.

В качестве примера можно привести перфузию в пористые волокна, применение микрокапсул, агарозных микрошариков или керамических кассет. Второй подход включает культивирование клеток в гомогенной суспензии. Выбор одного из этих двух методов получения моноклональных антител в основном определяется требованиями производственного процесса.

Система получения моноклональных антител должна быть. Фирма Celltech для получения моноклональных антител использует культивирование в гомогенной суспензии. Преимущества этого метода включают все упомянутые факторы. Кроме того, при проведении процесса в суспензии за счет перемешивания достигается высокая гомогенность культуры. Эффективное перемешивание очень важно, так как при культивировании необходимо равномерное распределение клеток по всему объему сосуда.

При этих условиях результаты измерений рН или концентрации растворенного кислорода в одной определенной точке сосуда будут отражать состояние всей культуры клеток, в результате чего осуществляется простой и надежный контроль этих параметров. Хорошее перемешивание обеспечивает быстрое и равномерное распределение любого добавленного компонента во всем объеме. Кроме того, от эффективности перемешивания зависят параметры массопереноса в ферментере, особенно переноса кислорода.

Один миллион гибридомных клеток потребляет такое количество кислорода за один час. Таким образом, эффективное снабжение культуры клеток кислородом является очень важным фактором; в противном случае рост клеток будет лимитироваться кислородом. Культивирование в гомогенной суспензии имеет неоспоримые преимущества, когда возникает проблема масштабирования процесса.

Увеличение размера ферментера в десять раз требует увеличения капитальных затрат всего в два-три раза, а трудозатраты будут несравненно меньшими по сравнению с трудозатратами на одновременное культивирование в нескольких ферментерах меньшего размера. Гомогенность системы обеспечивает стабильность параметров. Более того, такая система дает наилучшие ВРЗ-можности для непосредственного наблюдения за параметрами процесса и их регулирования.

Традиционно в микробиологических процессах используют емкостные ферментеры с механическим перемешиванием. Подобные ферментеры объемом до л применяют для получения вируса ящура и интерферона.

В то же время фирма Celltech для выращивания гибридомных клеток использует ферментеры эрлифтного типа с активной подачей воздуха. Применение эрлифтных ферментеров для получения антител впервые описано Катингером и др. Принцип работы эрлифтного ферментера представлен на рис. Его подробное описание можно найти в обзоре. Реактор изготовляют из стекла для работ лабораторного масштаба и из нержавеющей стали при промышленном культивировании.

Газовую смесь подают из кольцевого барботера в основание тяговой трубы, расположенной соосно внутри ферментера. Газ, поднимаясь вверх по трубе, поступает к клеткам культуры и удерживается на ее поверхности. При подъеме газа по трубе создается разность плотностей между содержимым трубы и остальным объемом ферментера, в результате чего обеспечивается циркуляция культуры в ферментере. Вспенивание, которое может возникнуть при необходимой для роста клеток скорости подачи кислорода, обычно легко подавляется обычными антивспенивающими агентами.

Рост гибридомных клеток и синтез антител ими зависят от физико-химических характеристик микроокружения клеток. При этом особое внимание уделяется регулированию рН, концентрации растворенного кислорода, температуры и содержания питательных веществ. Адекватность процессов контроля и регулирования легче всего достигается в гомогенной системе.

В свою очередь для этого необходимо эффективное перемешивание, обеспечивающее соответствующие характеристики тепло- и массопереноса в ферментере. В эрлифтных ферментерах фирмы Celltech концентрация растворенного кислорода регулируется автоматически изменением скорости подачи воздуха в ферментер. Необходимый рН среды обеспечивается или введением в поток газа диоксида углерода, или добавлением гидроксида натрия в культуральную жидкость.

Температура в ферментере поддерживается с помощью воды, циркулирующей в термостатирующей рубашке ферментера. При необходимости вода нагревается или охлаждается в теплообменнике. Контроль за ростом клеток осуществляется путем асептического отбора проб из ферментера с последующим подсчетом клеток иа гемоцитометре.

Для дискриминации живых и мертвых клеток используют краситель трипановый голубой. Косвенное слежение за ростом клеток может осуществляться также путем измерения скорости потребления кислорода. Возможность прямого подсчета общего количества и количества жизнеспособных клеток в ферментере является несомненным преимуществом по сравнению с негомогенными системами культивирования.

Концентрацию антител в культуральной жидкости определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или с помощью ELISA. На неавтоматизированных предприятиях большую часть затрат на производство моноклональных антител составляют расходы на оплату труда. Поэтому ручной труд целесообразно автоматизировать. В нашем случае всем процессом можно управлять с помощью компьютера, который обеспечивает автоматическое включение и выключение необходимых клапанов и насосов на всех этапах процесса, в том числе на стадиях очистки, стерилизации, проведения основного процесса, сбора клеток и выделения антител.

В этом случае функции оператора ограничиваются только приготовлением питательной среды и общим наблюдением за ходом процесса. Однако осуществление высокой степени автоматизации невозможно без активного компьютерного самоконтроля, а также без проверки правильности выполнения всех технологических стадий.

Кроме того, компьютер должен сигнализировать об авариях и принимать необходимые меры в случае отказа той или иной основной или вспомогательной системы.

Обеспечение кислородом. Хотя клетки млекопитающих потребляют несравненно меньше кислорода, чем микроорганизмы, обеспечение гибридомных клеток кислородом в ходе культивирования является одним из наиболее важных факторов, определяющих общую эффективность процесса. Многие системы культивирования не обеспечивают поступление кислорода в количестве, достаточном для поддержания высокой плотности популяции клеток. Кроме того, кислород плохо растворяется в среде для культивирования.

Потребление кислорода гибридомами составляет 6—11 мкг на миллион клеток в час в зависимости от линии клеток и фазы их цикла роста. Измерения скоростей процессов переноса кислорода в эрлифтных ферментерах при различных скоростях подачи газа показали, что эти ферментеры в принципе обеспечивают намного большую скорость подачи кислорода, чем необходимо для роста культуры.

Такая эффективность в первую очередь достигается за счет барботажной системы, обеспечивающей высокую эффективность переноса кислорода; к тому же систему барботажа можно легко пересчитать при масштабировании процесса. Другим аспектом физиологии, животных клеток, которому уделяют все большее внимание, являются питательные среды. Исследования компонентов питательных сред, выполненные в различных лабораториях, явились основой; для создания ныне хорошо известных сред, а также понимания механизма гормонального регулирования.

Бессывороточные среды. В настоящее время наблюдается тенденция к производству моноклональных антител в средах с низким содержанием сыворотки или в бессывороточных средах, хотя публикаций о применении таких сред в промышленном масштабе очень немного. Преимущества таких сред по сравнению с обычными, содержащими 10 и более процентов сыворотки, заключаются в упрощении процесса и удешевлении продукции. В случае бессывороточных сред, кроме того, достигается более высокая воспроизводимость процесса, поскольку каждый компонент среды хорошо известен и может быть получен в очень чистом состоянии.

Наконец, бессывороточные синтетические среды полезны и в научно-исследовательских работах, поскольку в них можно селективно варьировать концентрацию любого компонента.

По сути дела, для проведения корректных научных исследований по росту гибридомных и других клеточных линий в первую очередь необходимо иметь хорошо охарактеризованную бессывороточную среду. Кинетика роста. До появления бессывороточных сред закономерности роста животных клеток изучали на средах, содержащих различные сыворотки.

Позднее оказалось, что кинетика роста и биосинтез антител гибридомными клетками на бессывороточных средах и в средах, содержащих сыворотку, очень близки. На рис. Клетки росли с временем удвоения 18 ч, максимальная плотность популяции была равна 3,2 млн. После ч ферментации выход антител составил 26 г. В других случаях время ферментации зависит от конкретной линии клеток и изменяется от до ч. Время удвоения клеток при этом составляет 11—36 ч, а максимальная плотность популяции — 1,0—4,6 млн.

Биосинтез антител. Эти изменения отражают характерные особенности каждой линии клеток. Отметим, что выход антител при культивировании в колбах или во вращающихся сосудах значительно ниже, чем в ферментерах. Более высокие выходы антител в ферментерах являются результатом оптимизации процесса, особенно в отношении состава культуральной среды.

Как видно из приведенных на рис. Было высказано обоснованное предположение, что синтезированные антитела не сразу секретируются клетками в культуральную среду. Позднее, в фазе отмирания, клетки лизируют и высвобождают находящиеся в них антитела.

Полученные результаты побудили провести специальные эксперименты по определению содержания антител в клетках в фазах роста и отмирания. Оказалось, что количество антител, которые удается выделить из гибридомных клеток после их разрушения с помощью замораживания — размораживания, в течение всех фаз роста практически постоянно и слишком мало, чтобы можно было объяснить наблюдаемую кинетику синтеза антител.

Полученный осветленный раствор содержит моноклональные антитела в низкой концентрации, поэтому обычно для облегчения последующих операций его концентрируют с помощью ультрафильтрации в тангенциальном потоке. При этом удаляются вода и низкомолекулярные примеси. В зависимости от области применения антител и от их свойств можно использовать самые различные способы очистки.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Моноклональные антитела, которые можно выработать против практически любого природного антигена, широко используются как в молекулярной биологии и биохимии, так и в медицине. Гибридомы продуцируют огромное количество моноклональных антител, обладающих уникальной специфичностью. Каждое антитело узнает только свой антиген, точнее, одну его детерминантную группу.

Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Путь решения проблемы неожиданно указали злокачественные опухоли.

Вполне естественно было желание иммунологов научиться получать плазмоцитомы, продуцирующие антитела заданной специфичности. Слишком редки были совпадения. Тогда попробовали индуцировать опухоли антителообразующих клеток опухолеродными вирусами. Успех пришел, как всегда, неожиданно, как побочный продукт исследования, имевшего иные цели. Для этого использовали вирус, способствующий слиянию клеток. Прежде всего был получен особый мутант мышиной плазмоцитомы, рост которого можно было контролировать составом питательной среды.

Рисунок 1. Схема получения гибридом. Рисунок 2. Процедуру повторяли 1—2 раза. Рисунок 3. Это будет продукт одного клона. Появление такого метода стало возможном благодаря развитию нескольких научных направлений.

Рисунок 4. Строение антител. Участок антигена, который распознается антителом, называется эпитопом. Паратоп образован участками, определяющими комплементарность complementarity-determining regions, CDR вариабельных доменов.

Для того чтобы это стало реальностью, сначала надо было создать библиотеки вариабельных доменов антител. Рисунок 5. Фаг-дисплейные библиотеки.

Долгое время попытки получить такие антитела были безуспешны. Рисунок 6. Роль К и Ксвязанных полимеров убиквитина в передаче сигнала от рецептора фактора некроза опухолей. Антитела, узнающие две конформации убиквитина, показаны разными цветами. Забыли пароль? Оглавление Содержание Как получить такие антитела? Дорогу указывают опухоли Как это было сделано? Моноклональные антитела. Редакторы Антон Чугунов Андрей Панов. Темы Биотехнологии Иммунология Медицина. Рассылка по электронной почте Один раз в месяц Один раз в неделю Отключена.

Вопросы пола. Носимые технологии. Синтетическая биология. Структурная биология. Эволюционная биология. Активные формы кислорода.

Гормоны растений. Ионные каналы. Внеклеточный матрикс. Мобильные генетические элементы. Генная инженерия. Квантовые точки. Нано био технологии. Секвенирование ДНК. Тканевая инженерия. Нобелевские лауреаты. Вирус Зика. Вирус Эбола. Генная терапия. Онкологические заболевания. Персонализированная медицина.

Стволовые клетки. Наглядно о ненаглядном. Итоги года. Наука из первых рук. Своя работа. Закрыть Вход Регистрация. Пароль Забыли пароль? Войти через соцсети Вконтакте Facebook Google. Зарегистрируйтесь через один клик Вконтакте Facebook Google. Публикация отправлена в дорогую редакцию. Что-то пошло не так. Проверьте ваше интернет-соединение.

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации.

Моноклональные антитела

Facebook ВКонтакте Одноклассники. Я даю согласие на обработку персональных данных и соглашаюсь с политикой конфиденциальности. Онлайн-журнал для фармацевтов и медицинских работников. ВКонтакте Facebook Одноклассники. Роза Ягудина о значении моноклональных антител в современной медицине и перспективах их применения. Моноклональные антитела МАТ сегодня применяются при лечении заболеваний, большинство из которых еще несколько десятков лет назад считались неизлечимыми.

Это онкологические, аутоиммунные, сердечно-сосудистые и инфекционные заболевания, воспалительные реакции различного генеза, системный склероз, идиопатический фиброз легких, гепатит В, СПИД, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, аллергические реакции, мышечная дистрофия, болезнь Альцгеймера, астма, диабет и другие заболевания. Препараты, изготовленные на основе моноклональных антител, относятся к новейшим в современной медицине.

С середины х годов до сегодняшнего дня на мировом фармацевтическом рынке одобрено более 30 лекарственных средств, имеющих в составе моноклональные антитела. Первоначально надежность методов и технологий производства моноклональных антител и безопасность их применения вызывали опасения у фармацевтических производителей.

Однако сегодня научный и медицинский опыт показал возможность их эффективного и безопасного применения в медицине. Сейчас большинство фармацевтических компаний работают над разработкой новых препаратов и лекарственных средств на основе моноклональных антител.

На этапе разработки в мире находится около МАТ. Роза Исмаиловна Ягудина , доктор фармацевтических наук, профессор, зав. Сеченова, г. Иллюстрации и примеры в статье взяты из: Ягудина Р. История получения и применения моноклональных антител уходит своими корнями в исследования конца 19 века. С тех пор, за прошедшие более чем сто лет, моноклональные антитела успели несколько раз совершить революцию в медицине, полностью перевернув представления о возможностях лекарственной терапии.

Ученых с давних пор интересовал вопрос о том, каким образом организм создает множество различных антител, обладающих уникальной специфичностью в отношении чужеродных веществ антигенов , и каким образом эти антитела работают. Один из первых шагов к ответу на этот вопрос был сделан группой ученых, работавших в Институте инфекционных болезней в Берлине и открывших методы лечения дифтерии. В конце XIX века дифтерия у детей считалась смертельным неизлечимым заболеванием. Врач иммунолог-бактериолог Эмиль Беринг Emil Behring предположил, что лечение дифтерии может быть успешным в случае проявления естественной защитной реакции человеческого организма, а именно, если секретируемый дифтерийными бактериями токсин нейтрализовать.

В г. Беринг совместно с японским ученым Сибасабуро Китасато установили, что неиммунизированные животные могут быть защищены от токсина дифтерийных бактерий с помощью инъекции антитоксина антитоксической сыворотки иммунизированных животных. Эмилю Берингу была присуждена Нобелевская премия за работу по сывороточной терапии.

Однако на тот момент эффективность сыворотки была достаточно низкой, поскольку антитела в сыворотке вырабатывались клетками животных, а не самого пациента и вызывали лишь пассивный иммунитет. Антитоксин необходимо было вводить сразу после инфицирования, иначе было слишком поздно. С середины х годов практика пассивной иммунизации сошла на нет в связи с открытием антибиотиков широкого спектра действия.

В х гг. Однако дальнейшая расшифровка структуры антитела была пока недоступна из-за их большого размера, в 20 раз превышавшего размер молекул белков, структуры которых к тому времени уже были расшифрованы. Только в г. Позже Родни Портеру совместно с Джеральдом Эдельманом Gerald Edelman удалось определить последовательность аминокислот, входящих в белковую цепь антитела, производимого клетками раковой опухоли миеломы.

В то время это была самая большая расшифровка аминокислотной последовательности, за что в году ученые получили Нобелевскую премию. В результате исследований Портера и Эдельмана стало известно, что антитело имеет форму буквы Y, в которой нижняя часть тяжелая цепь имеет постоянную структуру для разных антител, а плечи легкие цепи значительно различаются у различных антител. Именно эти плечи отвечают за связывание антитела с антигеном и его нейтрализацию.

Рисунок 1. Структура антитела, за которую ученые Родни Портер и Джеральд Эдельман в г. К м годам уже были известны некоторые важные моменты о том, каким образом в организме человека вырабатываются антитела. В частности, было известно, что за продуцирование антител отвечают В-лимфоциты, причем каждый В-лимфоцит может вырабатывать только одно специфическое антитело, при этом он редуплицируется и за счет этого быстро производит большое количество идентичных по структуре антител — так называемых моноклональных, то есть произошедших от одной клетки-предшественницы.

На тот момент была исследована способность клеток раковой опухоли миеломы быстро производить идентичные самим себе клетки. Кроме того, существовала возможность выделения антителопродуцирующих клеток из организма животных.

Технология Кёлера и Мильштейна включала несколько этапов: у мыши вырабатывался иммунитет к известному антигену, затем из ее селезенки выделялись антителопродуцирующие клетки, эти клетки с помощью особой технологии соединялись с клетками миеломы с получением гибридомы, клетки которой непрерывно в большом количестве синтезировали антитела против известного антигена.

Эта методика произвела переворот в изучении антител, поскольку позволила получать антитела с удивительно точным соответствием определенной структуре. В дальнейшем технология была усовершенствована, и в году Кёлер, Мильштейн и датский иммунолог Нильс Ерне Niels Jerne получили Нобелевскую премию за участие в создании антител, которые можно использовать для диагностических исследований и создания лекарственных средств.

В дальнейшем было разработано множество технологий, позволивших усовершенствовать синтез антител за счет развития технологий рекомбинации ДНК, технологий клонирования клеток и других достижений генной инженерии. При первых попытках применения для лечения людей антител, искусственно синтезированных из клеток животных, ученые столкнулись с трудностями. Однако было выявлено, что мышиные антитела в незначительной степени связывались с опухолевыми антигенами и воспринимались организмом как чужеродные клетки.

С г. Препарат имеет полностью мышиное происхождение, то есть синтезируется мышиными гибридомами, полученными слиянием мышиной миеломы и мышиных В-лимфоцитов. Вскоре после выхода препарата на рынок стало ясно, что при длительном применении мышиных моноклональных антител в качестве лекарственных средств их эффективность снижалась. Это связано с тем, что мышиные белки являются иммуногенными для организма человека, то есть воспринимаются как чужеродные объекты.

В связи с этим у пациентов, которым вводят мышиные антитела, быстро образуются человеческие антимышиные антитела human antimurine antibody — HAMA. Образующиеся HAMA-антитела нейтрализуют эффект мышиных антител. В начале х гг. Разработка химерных антител позволила практически полностью отказаться от использования мышиных антител. Однако в некоторых случаях использование мышиных антител и сегодня остается оправданным.

Два последних являются радиоактивно мечеными мышиными МАТ. Их функция заключается в доставке радиоизотопов к клеткам лимфомы. Наличие радиоактивной метки позволяет применять эти антитела в очень небольших количествах, поэтому иммуногенность, обусловленная мышиными последовательностями, в этом случае не так значима. То, что эти препараты включают именно мышиные, а не гуманизированные или человеческие формы делает их более эффективными, потому что гуманизированные формы могли бы связываться одновременно не только с клетками-мишенями, но и со здоровыми клетками, нанося им вред.

В конце х гг. Начиная с конца х гг. В х годах усовершенствованные методы генной инженерии наконец позволили добиться долгожданного результата и получить человеческие МАТ. В настоящее время человеческие МАТ чаще всего получают с помощью технологии трансгенных мышей мышей, выведенных с использованием фрагментов чужеродной ДНК или фагового дисплея особый метод генной инженерии с использованием вирусов-бактериофагов.

Разработка лекарственного средства с использованием моноклональных антител — это очень длительный и дорогостоящий процесс. Сегодня интерес к разработке новых препаратов на основе моноклональных антител со стороны производителей очень высок. В настоящее время на территории Российской Федерации стадию клинических исследований проходит более 10 препаратов на основе МАТ.

Общее количество препаратов, находящихся на стадии разработки в мире, исчисляется сотнями. Перед современными учеными, исследующими моноклональные антитела, стоит множество актуальных задач. В частности, поиск решения проблемы иммуногенности препаратов, изготовленных на основе МАТ.

Большинство препаратов на основе МАТ, которые сегодня проходят стадию клинических исследований, включают в состав человеческие антитела. Использование этого типа антител снизило иммуногенность препаратов, однако не устранило проблему полностью, поскольку иммунная система человека способна вырабатывать антитела против любого терапевтического белка.

Еще одна проблема, связанная с применением препаратов на основе моноклональных антител, обусловлена тем, что МАТ представляют собой крупные молекулы, которые не способны проникать внутрь клетки или глубоко в ткани. Сегодня МАТ нельзя применять внутрь, так как их концентрация для достижения эффекта должна в несколько тысяч раз превышать концентрацию молекул-мишеней. В связи с этими особенностями, сегодня ученые озабочены созданием нового поколения лекарственных средств, которые объединят в себе преимущества МАТ и мелкомолекулярных препаратов.

На этом пути сделано уже несколько важных научных открытий. Эти препараты характеризуются высокой стабильностью, что позволяет использовать их внутрь и местно. Кроме того, они просты в производстве. Наконец, еще одно сверхсовременное направление — разработка доменовых антител американской компанией Domantis. Эти антитела должны соответствовать различным отделам тяжелой и легкой цепи антител человека и быть в десять раз меньше обычного антитела, что позволит применять их внутрь и ингаляционно.

Пока что длительность и высокая стоимость производства лекарственных средств с использованием моноклональных антител делает их не всегда доступными для пациентов. Однако ученые работают над созданием новых технологий, которые позволят выпускать новые препараты быстрее и по более низкой стоимости. Благодаря современным технологиям, уже сегодня многие препараты стали доступными для большого количества пациентов и позволили излечить заболевания, ранее считавшиеся неизлечимыми.

Можно надеяться, что в будущем спектр излечимых заболеваний еще более расширится, а лекарственные средства на основе моноклональных антител станут еще более эффективными. В октябре г. МНН моноклональных антител должны включать в себя:. Редакция не несет ответственности за информацию, размещенную в рекламных материалах. Любое воспроизведение статей, перепечатка либо ссылка на них допускаются исключительно с письменного согласия редакции.

Академика Сандахчиева, Адрес редакции: , Новосибирская обл. Комментарии доступны только зарегистрированным пользователям Войти Зарегистрироваться. Список ЛС, которые лишились регистрации или были отозваны в апреле. Адреномиметики: справка по фармакологической группе. Журнал Новости Аптека: взгляд изнутри Интервью экспертов Ассортимент и продажи Изменения в инструкциях

Моноклональные антитела: исследования и применение

Антитела — белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызывающим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена.

Разрешив ряд методических проблем, Милстейн, Говард, Батчер из Института физиологии Кембридж успешно осуществили слияние клеток, продуцирующих моноклональные антитела против крысиного антигена тканевой совместимости — молекулы, ответственной за генетическую индивидуальность организма и реакцию отторжения трансплантата. Когда после слияния клеток двух различных линий образуется клон , антитела, которые он продуцирует, необязательно могут быть моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обеих родительских клеток, экспрессия которых ведет к продукции иммуноглобулинов селезеночных и миеломных клеток, но на ранних стадиях размножения гибридной клетки быстро утрачивается часть хромосом.

Такая утрата хромосом имеет неслучайный характер. Исходя из этого Д. Келер и Ц. Милштейн пытались выделить клоны, которые потеряли хромосомы, принадлежащие миеломе, и поэтому экспрессировали хромосомы иммунных лимфоцитов, то есть те которые, синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов НL , реагирующих с эритроцитами барана.

Такая селекция значительно бы облегчилась, если бы имелась мутантная миеломная линия, не продуцирующая иммуноглобулинов. Тогда в результате слияния получились бы только HL-гибридомы. Отобранные клоны могут храниться в замороженном состоянии. В любое время определенную дозу такого клона можно ввести животному той же линии, от которой были получены клетки для слияния.

У животного развивается опухоль, которая продуцирует моноклональные антитела заданной специфичности. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела выделять из культуральной жидкости. Милштейн и его сотрудники получили моноклональные антитела, направленные против антигенов малого размера, то есть гаптенов, белков, углеводов и гликолипидов, а также против вирусов и компонентов клеточной мембраны.

В настоящее время гибридомная технология получила широкое развитие. Теперь моноклональные антитела можно определить, как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного.

Моноклональные антитела очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном и затем в течение 6 — 12 мес. В то время как для получения антител традиционными методами необходимо приблизительно л сыворотки крови человека, полученной из крови доноров. Абсолютной воспроизводимостью, стандартностью и наивысшей из возможных специфичностью обладает моноклональные антитела, которые секретируются одним клоном антителообразующих клеток и идентичны не только по антигенной специфичности, но и по классу и типу тяжелых и легких цепей в молекуле.

Разделить клоны антителообразующих клеток, образующихся in vivo, невозможно, поэтому моноклональные антитела получают с использованием гибридомной технологии in vitro.

Продуцентом является гибридная клетка гибридома — продукт слияния В-лимфоцита, секретирующего антитела на определенный антиген и непрерывно растущей клетки миеломы. До недавнего времени для гибридизации использовали исключительно миеломные клетки и В-лимфоциты мышей или крыс, но продуцируемые ими моноклональные антитела имеют ограниченное терапевтическое применения, так как они представляют собой чужеродный белок для человеческого организма.

Освоение технологии получения гибридом на основе иммунных клеток человека связано со значительными трудностями : человеческие гибридомы растут медленно, сравнительно малостабильны, но уже получены гибридомы человека — продуценты моноклональных антител. Оказалась, что и человеческие моноклональные антитела в некоторых случаях вызывают иммунные реакции, и их клиническая эффективность зависит от правильного подбора класса антител, гибридомных линий, подходящих для данного больного.

К достоинствам человеческих моноклональных антител относится способность распознавать тонкие различия в структуре антигена, которые не распознаются моноклональные антитела мыши и крысы. Предприняты попытки получения химерных гибридом , сочетающих мышиные миеломные клетки и человеческие В-лимфоциты; такие гибридомы находят пока лишь ограниченное практическое применение.

Наряду с преимуществами моноклональные антитела имеют недостатки , порождающие проблемы их практического использования. Они не стабильны при хранении в высушенном состоянии, в то время как в смеси обычных поликлональных антител всегда присутствует группа антител, устойчивая при избранных условиях хранения.

Таким образом, неоднородность обычных антител дает им дополнительный резерв стабильности при изменении внешних условий, что соответствует одному из основных принципов повышения надежности систем. Моноклональные антитела нередко имеют слишком низкое сродство к антигену и чрезмерно низкую специфичность, что препятствует их применению против изменчивых антигенов, характерных для инфекционных агентов и опухолевых клеток.

Необходимо также отметить высокую стоимость моноклональных антител на международном рынке. Было предпринято множество попыток отыскать способы получения антител с узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокоиммуногенный препарат антител с узкой специфичностью, но большинство попыток оказались безуспешными.

Высокоспецифические антитела были получены, когда антителообразующие клетки перенесли в организм летально облученных животных и из селезенки извлекали локальные зоны, содержащие очаги пролиферации одного клона иммунных лимфоцитов. Эти клоны продуцировали в сущности моноклональные антитела, но их можно было выделить в очень незначительных количествах. Данные опыты имели лишь теоретическое значение для оценки числа клонов и не давали препаративного способа получения моноклональных антител.

В г. Милштейн предложили принципиально иной метод получения гомогенных антител. Они осуществляли слияние плазмацитомы с клетками селезенки иммунизированного животного, получив, таким образом, гибридомы, которые унаследовали от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки — синтезировать антитела предопределенной специфичности.

Этот метод очень быстро получил широкое распространение во всем мире Д. Милштейн в г. У мышей получить миеломы довольно легко. Опухоли индуцируют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного. Но миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей, так как не удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы, продуцирующие антитела к иммунизирующему антигену.

Таким образом, миеломные белки оказались с неизвестной антигенной специфичностью и в дальнейшем были использованы как источник поддержания неограниченной пролиферации. Разработка техники гибридизации соматических клеток широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации.

При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер — гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуются одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров, то есть образуется гибридная клетка.

Первоначально метод гибридизации соматических клеток использовали для изучения механизма регуляции дифференцированных функций, а также для соматических и генетических подходов к картированию генов. Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить, используя ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, мезолицитин, полиэтиленгликоль ПЭГ. Механизмы слияния в значительной степени остаются до конца неизученными. Предполагают, что полиэтиленгликоль уменьшает заряд клеточной поверхности и сорбирует на себе воду, облегчая тем самым взаимный контакт плазматических мембран соседних клеток.

Частота образующихся гибридов, даже при использовании агентов, повышающих слияние, крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды , позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее время разработано несколько методов селекции гибридных клеток. Одним из наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы: гипоксантин, аминоптерин и тимидин ГАТ. В системе ГАТ используется антагонист фолиевой кислоты — аминоптерин.

Тетрагидрофолиевая кислота является коферментом, необходимым для превращения 5—аминоимидазолкарбоксамида АИКР в рибонуклеотид формиамидоимидазолкарбоксамида ФАИКР в биосинтезе пуринов и в биосинтезе пиримидинов.

Аминоптерин предотвращает образование тетрагидрофолята, ингибируя гидрофолятредуктазу, и таким образом, блокирует процессы биосинтеза, как пуринов, так и пиримидинов. В клетках существуют обходные пути биосинтеза нуклеотидов, в которых происходит реутилизация гипоксантина и тимидина.

Эти пути зависят от двух ферментов: тимидинкиназы ТК , катализирующей превращение тимидина в дезокситимидинтрифосфат, и гипоксантингаунинфосфорибозилтрансферазы ГГФРТ , катализирующей трансформацию гипоксантина в инозинмонофосфат и гуанина в гуанозинмонофосфат.

При добавлении в среду гипоксантина и тимидина клетки могут нормально синтезировать ДНК в условиях, когда основной путь биосинтеза блокирован аминоптерином. Если клетка имеет дефект по этим ферментам, то в присутствии аминоптерина она погибает, но способна к выживанию, если ее слить с другой клеткой, у которой эти ферменты есть.

Двойной , или полной селективной, системой является такая система, когда происходит слияние двух клеток, в одной из которых отсутствует ТК, в другой — ГГФРТ. В гибридах идет взаимная комплементация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ, тогда как родительские клетки погибают. Для получения и отбора мутантных клеток, не имеющих ТК и ГГФРТ, используют токсические аналоги пуринов и пиримидинов, добавляемые одновременно с мутагенными агентами.

Эти аналоги включаются в ДНК с помощью указанных ферментов. В присутствии токсических аналогов выживают только те клетки, где нет фермента, способного к включению этого аналога в ДНК.

Так, в присутствии 8-азагуанина или 6-тиогуанина выживают только клетки без фермента ГГФРТ, а в присутствии 5-бромдезоксиуридина — клетки без фермента ТК. Селекция гибридов основана на том, что в среде ГАТ родительские миеломные клетки погибают, а клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования, поэтому выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Но в гибридах синтезировались не только антитела клеток иммунной селезенки, но и иммуноглобулины родительской миеломы, а также гибридные молекулы, состоящие из полипептидных цепей, как миелом, так и селезенки. Данная проблема будет преодолена путем использования миеломных клеток, в которых отсутствовала экспрессия собственных цепей иммуноглобулинов.

Для получения гибридом: В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс. Клетки миеломы плазмоцитомы — это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждая из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro. На практике чрезвычайно сложно получить миелому с заданной антигенной специфичностью, поэтому получают гибридные клетки-продуценты моноклональных антител, наследующие от миеломного партнера только способность к неограниченному размножению.

Клетки плазмоцитомы, используемые для гибридизации, получают путем мутагенеза. Они должны иметь такие селективные маркерные признаки как устойчивость к 8-азогуанину и бромдезоксиуридину — токсичным аналогам азотистых оснований, входящих в состав ДНК. Такая устойчивость обусловлена неспособностью клетки синтезировать ферменты гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу ГГФРТ и тимидинкиназу ТК , которые участвуют в процессах включения пуринов и пиримидинов в синтез нуклеиновых кислот по резервному пути биосинтеза в клетках млекопитающих.

ГГФРТ участвует в синтезе пуринов, а ТК — пиримидинов при наличии соответствующих предшественников гипоксантина и тимидина. Выделение мутантов, неспособных к синтезу ферментов, осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последующим культивированием их в среде, содержащей 8-азогуанин и бромдезоксиуридин. При выборе миеломной линии необходимо учитывать, что в процессе культивирования клеточные линии могут терять способность к слиянию в результате перерастания, потери устойчивости к аминоптерину или заражения микоплазмой.

Поэтому успех гибридизации во многом будет определяться тем, в каком состоянии находится миеломная линия, которую выбрали для слияния. Схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируются и определяются имеющимся типом и количеством антигена.

Иммунизация должна стимулировать формирование иммунного ответа и выраженное антителообразование. Антиген вводят внутривенно, внутрибрюшно или подкожно с адъювантом веществом, усиливающим иммуногенность антигенов или без него в нарастающей дозе.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это осложняет отбор клонов, синтезирующих нужные антитела. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере, на ее последних этапах.

Однако одним из основных достоинств гибридомной технологии является именно то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и затем использовать эти антитела для его очистки. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться образовывать антителопродуцирующие гибридные клетки.

Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделить селезеночные лимфоциты животных через 3 — 4 суток после последней иммунизации, то есть когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток. Существует большое число способов и схем иммунизации. Схемы иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков — слабые иммуногены.

В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ животного. Среди адъювантов широкое распространение получил полный адъвант Фрейда ПАФ. Помимо этого используют введение антигена, преципитированного на квасцах вместе с антигеном убитых клеток Bordetella pertussis.

Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития иммунного ответа.

ВИДЕО ПО ТЕМЕ: Моноклональные антитела при злокачественных лимфопролиферативных заболеваниях

Комментариев: 1

  1. amos_k:

    Интересная подборка…про соль знала, а вот про кошку и зеркало, так подробно не знала. Спасибо.